关于WT质粒构建，酶切法和同源重组法之前都分享过，今天写了下关于突变体和缺失体质粒构建的protocol，主要是引物设计和载体选择的问题❗️ ✅设计引物： 1、 首先要保证已有WT plasmid。教程在图2图3，引物设计之后pcr大概3～5小时，看载体长度，然后就是DpnI酶消化，紧接着就是重组反应，感受态转化了，缺失体和突变体都可以用，设计引物有相似之处，这种方法是以整个质粒为模版的，采用的酶也都是高高高保真酶。 2、 类似于同源重组反应，以突变体为中心，选择突变氨基酸的前8个碱基，和突变氨基酸的后20个碱基，再加上突变后的氨基酸（3个碱基），这就是引物的组成。 ✅载体的选择： 1、做瞬转就WT，突变体都用普通载体即可，大概4000～5000bp左右，做稳转可用慢病毒载体，大小不等，基本都大于9000bp，同一个基因的WT，突变体，缺失体，截断体都要用同一类型载体，最好不要更换。[举手R] 2、保证质粒载体没有问题，无论是各种载体元件还是载体表达能力。 3、要用表达相对稳定的载体，蛋白表达能力和载体关系很大，见过用着用着就不表达了的质粒，可能就是载体本身不行，这种直接pass。👾 4、做突变体和截断体尽可能做到质粒表达能力一致，推荐大家使用云舟生物家的【VectorBuilder】去看载体相关信息，他们家的慢病毒载体就挺不错的！ 5、【VectorBuilder】载体家可以直接用手机进入官网，也可以用电脑，载体种类很多，根据自己需求选择，例如：哺乳动物基因表达载体，这里又分为好几大类，慢病毒载体等…除此之外还有果蝇，线虫… 6、如果需要修改元件，点击VectorBuilder里的设计载体即可自己设计，设计过程中会自动提示是否正确，除此之外也有教学视频可以看～‼️ 7、和普通其他有质粒合成的不太一样的点是： 他们基本只有几种并且自己无法修改或者设计，云舟生物家的载体可以自己设计，设计好之后下单即可，不下单的话自己设计的载体序列也可以文件形式导出，用别的ap*也能打开，有需要的宝可以去选择～❗️